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米谷 佳晃; 藤井 聡*; 皿井 明倫*; 河野 秀俊; 郷 信広*
no journal, ,
DNAの柔らかさと水和パターンはいずれも塩基配列に依存し、その配列による違いが蛋白質との複合体形成を左右する可能性があるため重視されてきた。これらの配列依存性はこれまでも研究されてきたが、両者が互いにどのように関係しているのかはよくわかっていなかった。本研究では、4塩基配列の全パターン(136通り)に対する分子動力学計算のトラジェクトリーを系統的に解析し、DNAの柔らかさとマイナーグルーブの水和パターンの間に明確な相関があることを明らかにできたので報告する。両者の配列依存性は、塩基対ステップのレベルで記述することができ、その関係は次の4つのタイプにより特徴づけられる。タイプ1:硬い塩基対ステップの大部分は、1-ブリッジの水和パターン(斜め向いの塩基対が1個の水分子で橋渡しされる)が高い確率で形成する。タイプ2:硬い塩基対ステップの中にごくまれに、2-ブリッジの水和パターン(斜め向いの塩基対が2個の水分子で橋渡しされる)を形成しやすいものがある。タイプ3:柔らかい塩基対ステップは、1-ブリッジと2-ブリッジのいずれの水和も形成しにくく、一定した水和パターンはみられない。タイプ4:中間の柔らかさを持つ塩基対ステップは、1-ブリッジと2-ブリッジの2状態を頻繁に遷移し、各水和パターンが出現する確率は中間的な値である。解析を通じて明らかになった水和パターンの配列依存性が蛋白質との相互作用にどのように寄与するのかという問題についても議論する。
栗原 和男; 玉田 太郎; 大原 高志; 黒木 良太
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生体反応や分子認識における水素や水和水の役割を解明するため、原子力機構研究炉(JRR-3)に設置された2台の生体高分子用単結晶中性子回折装置(BIX-3, 4)を運用し、高度化を行っている。2008年度は、提供される173日間(2台で346日)のビームタイムのうち約30%に相当するビームタイムを施設共同利用に提供した。発表では、2007年から2008年に実施した中性子回折実験の概要を紹介するとともに、これまでに立体構造決定に使用されたデータセット16件の結果から、中性子回折実験に必要な蛋白質結晶の体積や測定時間をまとめた。定常炉中性子を用いた中性子回折実験での単結晶の体積は、おおむね1
8mm
で測定時間は25日50日であった。この測定時間を考慮するとBIX-3, 4では年間に714構造の決定が可能である。また、本回折計ではこれまでに最高1.4
分解能のデータ取得に成功している。さらに近年では、同一の結晶から中性子回折データとX線回折データの両方を取得し、統合して1つの立体構造モデルを得るN+X構造解析法を利用して構造決定を行っている。この手法の有効性についても紹介する。
大原 高志; 安達 基泰; 玉田 太郎; 黒木 良太; 近藤 英昌*; 西宮 佳志*; 津田 栄*
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不凍タンパク質(AFP)はおもに極地に生息する魚類の体内に含まれるタンパク質で、氷の表面に結合することで氷結晶の成長を抑制し、体液の凝固点を下げる働きを持つ。北海道沿岸に生息するナガガジの体内では多数の3型AFP(nfeAFP)のアイソフォームが発現しており、これらはSP-及びQAE- sephadex結合グループに分類される。どちらのアイソフォームも氷表面に結合する機能は有するが、氷結晶の成長を抑制し、体液の凝固点を下げる機能は両者で大きく異なる。そこで、われわれは両者におけるタンパク質分子周辺の水和水ネットワークを解明し、その違いを明らかにすることでAFPの活性のメカニズムを解明することを目的として、nfeAFPの中性子構造解析に取り組んでいる。本発表では、SP型のnfeAFPであるnfeAFP6の大型結晶作製と単結晶中性子回折実験について報告する。
Rの結晶化正山 祥生; 玉田 太郎; 黒木 良太; 木村 成伸*; 竹田 一旗*; 林 拓郎*; 三木 邦夫*
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NADH-シトクロム 還元酵素(b5R)は、FADを持つピリジンヌクレオチド酵素でNADHからcytochrome への電子伝達を触媒する酵素である。このb5Rは脂肪酸代謝や薬物代謝酵素であるシトクロムの還元に関与することが明らかにされている。そこでわれわれはb5Rの構造活性相関を解明するとともに、薬物相互作用にかかわるCYPのb5Rによる還元機構を解明するため、中性子構造解析によって詳細な立体構造の解析を行うことを目標としている。そのためにまず既報告の手法でブタ肝臓由来のb5Rの膜外領域に存在する触媒ドメインの大腸菌による大量調製を行い、発現したb5Rを各種クロマトグラフィーによって高純度に単離精製した。その結果、大腸菌培養液1Lあたり15mgのb5Rを取得した。この試料を用いてb5Rの大型結晶作成に取り組み、マクロシーディングを行った結晶化溶液にタンパク質試料を逐次添加することで体積が約4mmの大型結晶の調製に成功した。また、この結晶を重水溶液に浸漬し予備的中性子回折実験を行ったところ、最大分解能が2程度の回折点を得ることに成功した。
玉田 太郎; 大原 高志; 栗原 和男; 黒木 良太
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X線回折が原子核を取り巻く電子からの散乱によって生じる回折現象であるのに対し、中性子回折は原子核そのものとの相互作用によって生じる回折現象である。したがって同じ原子を観測してもその位置や見え方に特徴的な差が生じる。水素原子の中性子散乱長は炭素や酸素原子などと同程度であるため、中性子結晶構造解析では水素原子を通常の2程度の分解能でも容易に決定できる。またこの2つの方法で観測された水素原子の位置は、C-H結合においては通常0.1強の差が見られる。また特殊な環境に存在する酵素の触媒基の電子状態と原子核の位置にどのような違いがあるのかは大変興味深い。このように中性子とX線の特徴的な違いをうまく利用した構造解析を行えば、タンパク質が関与するさまざまな生命反応をより深く理解することができるようになると思われる。われわれは中性子とX線の相補的な性質を利用した立体構造解析をN-X構造解析と呼び、医学生物学的に重要なタンパク質の立体構造解析を進めている。本発表では、われわれのN-X構造解析への取り組みを紹介するとともに、近年実施した2つの創薬標的タンパク質のN-X構造解析例を紹介する。
安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生; 松村 浩由*; 杉山 成*; et al.
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本研究では、HIV-1プロテアーゼとその阻害剤分子との分子間相互作用を原子レベルで解明することを目的として、阻害剤KNI-272との複合体の中性子結晶構造解析を実施した。HIV-1プロテアーゼ遺伝子のコドン配列を大腸菌発現に最適化した人工遺伝子を合成し、大量発現系を確立した。精製には、陽イオン交換及び逆相クロマトグラフィーを用い、自己分解物を除去した純度の高い試料を調製した。結晶化は、2液バッチ法により行い、体積3.6mmの大型結晶を作製することに成功した。得られた結晶からJAEAのJRR-3に設置している回折計BIX-4にて1.9分解能の中性子回折データを収集した。さらに1.4分解能のX線回折データも収集し、プログラムPHENIXにより中性子とX線の両方の回折データを用いて立体構造を精密化した。中性子のデータに対しR値19.3% (freeR値22.2%)、X線のデータに対しR値17.3%(freeR値20.3%)まで構造を精密化した。その結果、2つの触媒残基(Asp25及びAsp125)のプロトン化状態と水素原子を含めた立体構造を実験的に明らかにすることができた。